Resumen del contenido principal sobre cromatografía en columna con gel de sílice

1. Principio de separación

La cromatografía en columna con gel de sílice logra la separación basándose en la diferencia en la capacidad de adsorción de las sustancias sobre el gel de sílice. Las sustancias con mayor polaridad son fácilmente adsorbidas por el gel de sílice, mientras que aquellas con menor polaridad no lo son. Todo el proceso es un ciclo de «adsorción → desorción → re-adsorción → re-desorción».

2. Selección de la fase móvil

Los diferentes sistemas de disolventes se ajustan según la polaridad de las sustancias, y los problemas de arrastre pueden resolverse de manera específica:

• Para sustancias con baja polaridad: se utiliza el sistema acetato de etilo : éter de petróleo.

• Para sustancias con polaridad relativamente alta: se utiliza el sistema metanol:cloroformo.

• Para sustancias con alta polaridad: se utiliza el sistema metanol : agua : n-butanol : ácido acético.

• Cuando se produce una cola: Se añade una pequeña cantidad de agua de amoníaco o ácido acético glacial.

3. Pasos operativos principales (8 pasos)

1. Pesar Seleccione gel de sílice de malla 200-300, y la dosis será de 30 a 70 veces el volumen de carga de la muestra. Para separaciones extremadamente difíciles, se utiliza 100 veces la cantidad de gel de sílice H (la densidad aparente del gel de sílice seco es de aproximadamente 0,4; por ejemplo, 40 g de gel de sílice pueden medirse como 100 ml con una taza medidora).

2. Haciendo lechada Añada un disolvente con el mismo volumen que el gel de sílice seco y agite (por ejemplo, si el eluyente es un sistema éter de petróleo/acetato de etilo/acetona, mezcle con éter de petróleo; si es un sistema cloroformo/ alcohol, mezcle con cloroformo). El disolvente debe estar seco (se utiliza sulfato de sodio anhidro para acetato de etilo/acetona, y cloruro de calcio anhidro para cloroformo). Para muestras sensibles a ácidos, evite utilizar el sistema de cloroformo.

3. Empaquetado de columnas Tape herméticamente la parte inferior de la columna con algodón, añada 1/3 del volumen de éter de petróleo (o cloroformo), coloque una ampolla de almacenamiento de líquido, abra el émbolo, vierta la suspensión en la columna de una sola vez y enjuague el gel de sílice residual en la ampolla de almacenamiento de líquido con disolvente.

4. Compactación Una vez que el gel de sílice se asiente, añada más éter de petróleo y presurice con un doble bulbo o una bomba de aire hasta que la velocidad de flujo sea constante. El lecho de la columna se comprime hasta alcanzar 9/10 de su volumen original (esto puede mejorar la resolución y evitar que se agriete el lecho de la columna).

5. Carga de muestra Se pueden utilizar tanto métodos secos como húmedos, y no es necesario utilizar arena de mar. Después de cargar la muestra, añada una pequeña cantidad de eluyente y luego coloque una bolita de algodón absorbente cerca de la superficie del gel de sílice para evitar que el gel de sílice se dañe por la adición posterior de eluyente.

6. Paso y recolección de columnas Se recomienda la elución en gradiente (para equilibrar la difusión y la separación). Ejemplo: Para una carga de muestra de 10 mg, se utiliza 0,5 ml por fracción; para una carga de muestra de 1-2 g, se utilizan 20-50 ml por fracción.

7. Detección Se prefieren agentes especiales de revelado en spray (su sensibilidad es 1-2 órdenes de magnitud superior a la de las lámparas UV, lo que reduce la pérdida de producto).

8. Presentación de espectroscopía Recoge el producto, gíralo hasta que quede seco y vuelve a cristalizarlo antes de enviarlo para espectroscopía. Cuando la muestra sea pequeña o esté en forma líquida, pásala por una pequeña columna de gel para eliminar el «pico de gel de sílice» alrededor de 1,5 ppm en el espectro de hidrógeno.

4. Precauciones operativas

• Empaquetado de columnas No aplique lubricante al émbolo (para evitar la contaminación del producto). La columna debe estar «apropiadamente apretada y uniforme», y está prohibido que presente grietas (pues esto afecta la separación o incluso puede hacer que la columna sea inútil). Las pequeñas burbujas de aire pueden eliminarse mediante presurización, y se requiere más práctica para evitar la generación frecuente de burbujas.

• Adición de muestra Disuelva la muestra con una pequeña cantidad de disolvente antes de cargarla. Espere hasta que la capa de disolvente descienda hasta la superficie de la arena de cuarzo, y repita el proceso 2-3 veces con una pequeña cantidad de disolvente de baja polaridad. Al añadir el eluyente, no aplique presión inicialmente; espere hasta que la distancia entre el disolvente y la capa de muestra alcance 2-4 cm antes de aplicar presión, para evitar que la muestra sea arrastrada rápidamente hacia abajo.

• Selección del eluyente El valor de Rf de la sustancia objetivo debe ser de 0,2 a 0,3. Cuando Rf = 0,6, incluso una diferencia de 0,2 dificulta la separación. Esto se debe a que la columna experimenta múltiples procesos de ascenso en platos, y un valor de Rf más bajo conduce a una mejor eficiencia de separación.

• Recolección de muestras Las sustancias con fuerte adsorción pueden eluir más tarde (mientras que las que tienen débil adsorción eluyen primero). En lugar de ello, se puede utilizar alúmina como fase estacionaria. El tamaño del tubo de ensayo debe coincidir con el volumen de la muestra (utilice tubos de ensayo pequeños para muestras pequeñas a fin de evitar recoger múltiples muestras a la vez).

• Tratamiento final Los productos separados por columna deben lavarse con una pequeña cantidad de disolvente (para eliminar impurezas disueltas en el disolvente), y es necesario realizar una recristalización si así se requiere. Los disolventes volátiles (éter, diclorometano) o las temperaturas ambientales elevadas son propensos a la formación de burbujas; en su lugar, se pueden utilizar disolventes de alto punto de ebullición. En el caso de disolventes mixtos, deben seleccionarse aquellos con puntos de ebullición similares (por ejemplo, acetato de etilo + éter de petróleo a 60-90℃). Presurice para expulsar completamente el aire antes de llenar la columna.

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